¿Sabias que existen microorganismos que no hemos podido cultivar?

Humberto González y Reyna Fierro

Cuando tomamos una muestra del suelo, la suspendemos en agua estéril y tomamos una muestra para colocarla sobre un medio de cultivo rico, esperamos que la mayoría de las bacterias y hongos se desarrollen. Sin embargo, las técnicas de biología molecular, particularmente la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), ha permitido reconocer claramente la existencia de microorganismos que no hemos podido cultivar en el laboratorio y que a la fecha se conocen como "no cultivables" [8, 14]. Estos organismos que no hemos podido cultivar, se desarrollan o podrían desarrollarse en condiciones adecuadas por eso no están muertos sino que solamente “no los hemos podido cultivar en el laboratorio”.

Se ha podido aislar DNA del aire, de diferentes suelos, del interior de plantas, así como también de bacterias aisladas de aguas oceánicas o de fuentes termales, sin pasar por el de cultivo de los microorganismos. Este DNA se usa como molde para la amplificación, por PCR, de los genes ribosomales existentes en la muestra. Esto se logra con una DNA-polimerasa termoestable y oligonucléotidos complementarios (primers o cebadores universales) con las regiones conservadas de los genes ribosomales que se encuentran en todas las bacterias. Los fragmentos sintetizados se pueden clonar en vectores o se determina su secuencia nucleotídica directamente. Las secuencias obtenidas de los genes del RNA ribosomal se comparan con las existentes en los bancos de datos (ejm. Ribosomal Database Project [6]), hay más de 30000 existentes de un número casi igual de especies bacterianas. Con este enfoque, se ha revelado una diversidad que no es posible detectar con los métodos de microbiología tradicional [4, 13, 21]. También existen programas (tanto libres como comerciales) para verificar que las secuencias obtenidas de ADN ambientales no sean artefactos o quimeras, híbridos de genes de diferentes microorganismos [11]. Si las secuencias no se parecen a la de ningún microorganismo existente en más de un 97% es posible que se trate de una bacteria nueva, tal vez no cultivada. La secuencia obtenida permite también identificar fragmentos de secuencia que no se encuentran en ninguna otra especie reportada, o sea que son exclusivos de esta especie. Estas secuencias particulares pueden sintetizarse marcadas con nucleótidos fluorescentes y pueden utilizarse en las muestras originales para ver al microscopio el tipo y distribución de las bacterias que presentan los genes marcados, en microscopios de epifluorescencia, o en confocales. Visualizar a las bacterias es un paso hacia su aislamiento, pero cultivar a muchas de las que han sido detectadas de este modo no siempre ha sido posible. Por ejemplo, se ha podido activar bacterias del género Vibrio de un estado no cultivable, aunque, de manera no esperada, este proceso se inhibe con altas concentraciones de nutrientes [20], sin embargo estos resultados son controvertidos [4]. Por otro lado, se logró desarrollar un Bacillus de esporas de tal vez 250 millones de años [18]. Encontrar las condiciones para cultivar bacterias no cultivables es un reto para los microbiólogos [7].

Se ha acordado que a las bacterias "no cultivables" detectadas sólo por su secuencia de genes ribosomales se les designe como "candidatos". Algunos ejemplos de estas son las bacterias de gran tamaño, magnetotácticas acuáticas (obtenidas de un lago en Alemania) que se pegan a imanes, llamadas "Magnetobacterium bavaricum" [17] o el candidato  "Liberobacter", un patógeno de cítricos [9] que es cercano a bacterias simbiontes benéficas del género Mesorhizobium que crecen con facilidad en el laboratorio. La posición filogenética de las bacterias no cultivables se sitúa en ramas aisladas en el árbol universal aunque cerca de otros microorganismos.

No sólo se han detectado bacterias no cultivables sino también hongos, en particular, los que forman endo-micorrizas asociados a muchas plantas no se han podido hacer desarrollar en medios de cultivo en el laboratorio [2, 16].

Existen diversas opiniones en torno al problema de no poder cultivar microorganismos de los que se ha documentado su existencia. Se ha pensado que éstos pueden requerir nutrientes particulares que sólo se encuentran en condiciones naturales. Algunos nutrientes tal vez sean proporcionados por microorganismos asociados. En la naturaleza, es común encontrar comunidades bacterianas en las que coexisten varias especies y géneros de bacterias. En estas comunidades pueden existir dependencias metabólicas complejas. El enfoque de microbiología tradicional tiene como primer paso el obtener cultivos puros de bacterias (axénicos) y, tal vez, esto ocasiona que sólo se desarrollen parte de los miembros de la comunidad. Otra posibilidad, es que los medios típicos de crecimiento sean demasiado ricos, aún los medios mínimos tienen un exceso de carbono, de nitrógeno o de fósforo, y podrían inhibir el crecimiento de microorganismos que en condiciones naturales, viven precariamente. A estos microorganismos se les ha designado como oligótrofos, los microorganismos con comportamiento opuesto, que pueden vivir en medio ricos, se designan copiótrofos [10].

En hongos y bacterias se han identificado oligótrofos [1, 12, 19]; estos poseen sistemas de transporte de nutrientes de alta afinidad que les permiten tomarlos del medio en concentraciones muy bajas, prácticamente sin nutrientes. Estos microorganismos pueden crecer sobre vidrio, en agua destilada, sobre plásticos, tomando las trazas de compuestos volátiles del ambiente. En Pseudomonas, Flavobacterium y en otros géneros se han identificado oligótrofos [19]. Las bacterias fijadoras de nitrógeno pueden crecer en ausencia total de una fuente no gaseosa de nitrógeno, porque convierten el nitrógeno gaseoso de la atmósfera en NH₄⁺. Una manera de identificar fijadores de nitrógeno es por su crecimiento en medios libres de él, sin embargo, en estas condiciones también se pueden aislar falsos positivos, que son bacterias oligótrofas que toman trazas de amonio de la atmósfera pero que no fijan nitrógeno. Se ha calculado que en los laboratorios y hospitales existen concentraciones de amonio suficientes para mantener el crecimiento de oligótrofos (debido a agentes limpiadores o vapores de orina). Los oligótrofos deben considerarse como posibles agentes para la biorremediación, ya que se ha observado que, algunas bacterias, una vez que los contaminantes alcanzan concentraciones bajas, ya no pueden tomarlos ni degradarlos. Los oligótrofos, con alta afinidad por los contaminantes, tal vez pudieran finalizar la limpieza [3, 5, 15].

En resumen, existen bacterias y hongos que no se han logrado cultivar en el laboratorio. Estos microorganismos se detectaron amplificando parte de los genes ribosomales que son específicos para todos los organismos. Una buena parte de la investigación en microbiología se dedica a encontrar medios de cultivo adecuados para estos organismos “no cultivables”.

Referencias Bibliográficas

Glosario.

Biorremediación, Limpieza de contaminantes mediante agentes biológicos como bacterias.

Confocal, Sistema de microscopía en dónde la fuente luminosa es un láser que ilumina la muestra barriendo zonas muy pequeñas y que es analizado por computadora.

DNA-polimerasa, Enzima que sintetiza DNA a partir de un molde y desoxinucleótidos, requiere un cebador o primer complementario a una parte del molde.

Epifluorescencia, Sistema de microscopía en dónde se ilumina la muestra con un haz de luz ultravioleta que pasa por el ocular y se analiza la fluorescencia que produce la muestra.

Filogenética, Es la disciplina encargada de la reconstrucción de la historia evolutiva de los taxones es decir, los grupos de la clasificación de los seres vivos, que se representa en forma de árbol filogenético.

Genes ribosomales, información genética codificada en el DNA que dirige la síntesis del RNA ribosomal.

PCR, reacción en cadena de la polimerasa, síntesis del mismo fragmento de DNA varias veces tipo producción en cadena (~30). Para esto se requiere una enzima polimerasa de DNA que sea resistente a temperaturas elevadas (95°C) para que pueda desnaturalizarse en DNA antes de cada síntesis.

Primers, cadenas cortas de residuos de nucleótidos (normalmente 20 para PCR) que presentan un extremo 3' OH en dónde la DNA polimerasa puede empezar la síntesis de DNA

Vectores, vehículos genéticos en donde puede clonarse un fragmento de DNA y amplificarse o expresar la proteína que tienen codificada.