sábado, 14 de abril de 2012


Microscopio



Cristales de nieve vistos con unmicroscopio electrónico de barrido y coloreados artificialmente.
El microscopio (de micro-, μικρο, pequeño, y scopio, σκοπεω, observar) es un instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeños para ser vistos a simple vista. El tipo más común y el primero que se inventó es el microscopio óptico. Se trata de un instrumento óptico que contiene dos o más lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refracción. La ciencia que investiga los objetos pequeños utilizando este instrumento se llama microscopía.

Microscopio compuesto fabricado hacia1751 por Magny. Proviene del laboratorio del duque de Chaulnes y pertenece al Museo de Artes y +Oficios, París
El microscopio fue inventado hacia los años 1610, según los italianos, o por Zacharias Janssen en 1590, en opinión de los holandeses. En 1665 aparece en la obra de William Harvey sobre la circulación sanguínea al observar al microscopio los capilares sanguíneos y Robert Hooke publica su obra Micrographia.
En 1665 Robert Hooke observó con un microscopio un delgado corte de corcho y notó que el material era poroso, en su conjunto, formaban cavidades poco profundas a modo de celditas a las que llamó células. Se trataba de la primera observación de células muertas. Unos años más tarde, Marcello Malpighi, anatomista y biólogo italiano, observó células vivas. Fue el primero en estudiar tejidos vivos al microscopio.
A mediados del siglo XVII un holandés, Anton van Leeuwenhoek, utilizando microscopios simples de fabricación propia, describió por primera vezprotozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos. El microscopista Leeuwenhoek, sin ninguna preparación científica, puede considerarse el fundador de la bacteriología. Tallaba él mismo sus lupas, sobre pequeñas esferas de cristal, cuyos diámetros no alcanzaban el milímetro (su campo de visión era muy limitado, de décimas de milímetro). Con estas pequeñas distancias focales alcanzaba los 275 aumentos. Observó los glóbulos de la sangre, las bacterias y los protozoos; examinó por primera vez los glóbulos rojos y descubrió que el semen contiene espermatozoides. Durante su vida no reveló sus métodos secretos y a su muerte, en 1723, 26 de sus aparatos fueron cedidos a la Royal Society de Londres.
Durante el siglo XVIII continuó el progreso y se lograron objetivos acromáticos por asociación de Chris Neros y Flint Crown obtenidos en 1740 porH. M. Hall y mejorados por John Dollond. De esta época son los estudios efectuados por Isaac Newton y Leonhard Euler. En el siglo XIX, al descubrirse que la dispersión y la refracción se podían modificar con combinaciones adecuadas de dos o más medios ópticos, se lanzan al mercado objetivos acromáticos excelentes.
Durante el siglo XVIII el microscopio tuvo diversos adelantos mecánicos que aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso, aunque no se desarrollaron por el momento mejoras ópticas. Las mejoras más importantes de la óptica surgieron en 1877, cuando Ernst Abbe publicó su teoría del microscopio y, por encargo de Carl Zeiss, mejoró la microscopía de inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro, lo que permite obtener aumentos de 2000. A principios de los años 1930 se había alcanzado el límite teórico para los microscopios ópticos, no consiguiendo éstos aumentos superiores a 500X o 1,000X. Sin embargo, existía un deseo científico de observar los detalles de estructuras celulares (núcleo, mitocondria, etc.).
El microscopio electrónico de transmisión (TEM) fue el primer tipo de microscopio electrónico desarrollado. Utiliza un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo aumentos de 100.000X. Fue desarrollado por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en 1931. Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrónico de barrido (SEM).

Tipos de microscopios


Microscopio electrónico de barrido.


                      Microscopio óptico
                      Microscopio simple
                      Microscopio compuesto
                      Microscopio de luz ultravioleta
                      Microscopio de fluorescencia
                      Microscopio petrográfico
                      Microscopio en campo oscuro
                      Microscopio de contraste de fase
                      Microscopio de luz polarizada
                      Microscopio confocal
                      Microscopio electrónico
                      Microscopio electrónico de transmisión
                      Microscopio electrónico de barrido
                      Microscopio de iones en campo
                      Microscopio de sonda de barrido
                      Microscopio de efecto túnel
                      Microscopio de fuerza atómica
                      Microscopio virtual
                      Microscopio de antimateria
                      Microscopio reflector
                      Microscopio telegramatico
                      Microscopio nuclear

 



Microscopio óptico


Descripción:A) ocular, B) objetivo, C) portador del objeto, D) lentes de la iluminación, E) sujeción del objeto, F) espejo de la iluminación.
Un microscopio óptico es un microscopio basado en lentes ópticos. También se le conoce como microscopio de luz, (que utiliza luz o "fotones") o microscopio de campo claro. El desarrollo de este aparato suele asociarse con los trabajos de Anton van Leeuwenhoek. Los microscopios de Leeuwenhoek constaban de una única lente pequeña y convexa, montada sobre una plancha, con un mecanismo para sujetar el material que se iba a examinar (la muestra o espécimen). Este uso de una única lente convexa se conoce como [da], en el que se incluye la lupa, entre otros aparatos ópticos.

Historia

                      1608 Zacharias Jansen construye un microscopio con dos lentes convergentes.
                      1611 Kepler sugiere la manera de fabricar un microscopio compuesto.
                      1665 Robert Hooke utiliza un microscopio compuesto para estudiar cortes de corcho y describe los pequeños poros en forma de caja a los que él llamó "células". Publica su libro Micrographia.
                      1674 Leeuwenhoek informa su descubrimiento de protozoarios. Observará bacterias por primera vez 9 años después.
                      1828 W. Nicol desarrolla la microscopía con luz polarizada.
                      1838 Schleiden y Schwann proponen la teoría de la célula y declaran que la célula nucleada es la unidad estructural y funcional en plantas y animales.
                      1849 J. Quekett publica un tratado práctico sobre el uso del microscopio.
                      1876 Abbé analiza los efectos de la difracción en la formación de la imagen en el microscopio y muestra cómo perfeccionar el diseño del microscopio.
                      1881 Retzius describe gran número de tejidos animales con un detalle que no ha sido superado por ningún otro microscopista de luz. En las siguientes dos décadas él, Cajal y otroshistólogos desarrollan nuevos métodos de tinción y ponen los fundamentos de la anatomía microscópica.
                      1886 Carl Zeiss fabrica una serie de lentes, diseño de Abbé que permiten al microscopista resolver estructuras en los límites teóricos de la luz visible.
                      1908 Köhler y Siedentopf desarrollan el microscopio de fluorescencia.
                      1930 Lebedeff diseña y construye el primer microscopio de interferencia.
                      1932 Zernike inventa el microscopio de contraste de fases.
                      1937 Ernst Ruska y Max Knoll, físicos alemanes, construyen el primer microscopio electrónico.
                      1952 Nomarski inventa y patenta el sistema de contraste de interferencia diferencial para el microscopio de luz.

Partes del microscopio óptico y sus funciones








1 * Ocular: lente situada cerca del ojo del observador. Capta y amplía la imagen formada en los objetivos.
2 * Objetivo: lente situada cerca del revolver. Amplía la imagen, es un elemento vital que permite ver a través de los oculares
3 * Condensador: lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.
4 * Diafragma: regula la cantidad de luz que llega al condensador.
5 * Foco: dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
6 * Tubo: es una cámara oscura unida al brazo mediante una cremallera.
7 * Revólver: Es un sistema que agarra los objetivos, y que rota para utilizar un objetivo u otro
8 * Tornillos macro y micrométrico: Son tornillos de enfoque, mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El macrométrico lo hace de forma rápida y el micrométrico de forma lenta. Llevan incorporado un mando de bloqueo que fija la platina a una determinada altura.
9 * Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparación, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminación situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento permite mover la preparación de delante hacia atrás o de izquierda a derecha y viceversa.
10 * Base: Es la parte inferior del microscopio que permite el sostén del mismo.

Sistema de iluminación

La fuente de luz (1), con la ayuda de una lente (o sistema) (2), llamada colector, se representa en el plano del diafragma iris de abertura (5) del condensador (6). Este diagrama se instala en el plano focal anterior del condensador (6) y puede variar su abertura numérica. El diagrama iris (3) dispuesto junto al colector (2) es el diafragma de campo. La variación del diámetro del diafragma de campo permite obtener su imagen igual al campo visual lineal del microscopio. La abertura numérica del condensador (6) supera, generalmente la de la abertura del objetivo microscópico. es la iluminacion que permite ver mejor lo que queremos observar como las células o las membranas celulares entre otros

 

Microscopio compuesto.
Un microscopio compuesto es un microscopio óptico con más de un lente. Se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes, o cortados en láminas tan finas que se transparentan.

Principales elementos de un microscopio básico


Diagrama simple de la óptica de un microscopio.
Los microscopios de este tipo suelen ser más complejos, con varias lentes en el objetivo como en el ocular. El objetivo de éstas lentes es el de reducir la aberración cromática y la aberración esférica. En los microscopios modernos el espejo se sustituye por una lámpara que ofrece una iluminación estable y controlable.
Los microscopios compuestos se utilizan para estudiar especímenes delgados, puesto que suprofundidad de campo es muy limitada. Por lo general, se utilizan para examinar cultivos, preparaciones trituradas o una lámina muy fina del material que sea. Normalmente depende de la luz que atraviese la muestra desde abajo y usualmente son necesarias técnicas especiales para aumentar el contraste de la imagen.
La resolución de los microscopios ópticos está restringida por un fenómeno llamado difracción que, dependiendo de laapertura numérica (AN) del sistema óptico y la longitud de onda de la luz utilizada (longitud de onda), establece un límite definido (d) a la resolución óptica. Suponiendo que las aberraciones ópticas fueran despreciables, la resolución sería:

Normalmente, se supone una longitud de onda de 550 nm, correspondiente a la luz verde. Si el medio es el aire, la AN práctica máxima es de 0,95, y en el caso de aceite de hasta 1,5.
Ello implica que incluso el mejor microscopio óptico está limitado a una resolución de unos 0,2 micrómetros.

Poder separador, objetivos de inmersión y aumento útil

                      Poder separador
                       
De la teoría de la difracción sobre la formación de imágenes mediante un microscopio se obtiene que la distancia mínima entre dos puntos visibles por separado es:

Donde λ es la longitud de onda de la luz monocromática en la que se observa el objeto y A es la abertura del microscopio.
                      Objetivos de inmersión
El medio óptico líquido que rellena el espacio entre el objeto y el objetivo se le denomina líquido de inmersión. El índice de refracción de este es próximo al del vidrio (se utiliza agua, glicerina,aceites de cedro y de enebro, monobromonaftalina, entre otros).1

Correcciones

                      Tipos de objetivos y sus características.
Aunque todos los componentes que constituyen un microscopio son importantes, los objetivos son de suma importancia, puesto que la imagen, en definitiva, depende en gran medida de su calidad. Los mejores objetivos son aquellos que están corregidos para las aberraciones.

Las aberraciones

Son alteraciones ópticas en la formación de la imagen debidas a las propias lentes del objetivo.
   aberraciones geométricas (efecto Keystone)2
        aberraciones cromáticas

Corrección de las aberraciones

Para evitar las aberraciones geométricas se construyen los llamados objetivos planos o planáticos, lo cual suele estar indicado en el propio objetivo con la inscripción PLAN. Los objetivos que están corregidos para las aberraciones cromáticas se denominan acromáticos (corregidos para el rojo y el azul), semiapocromáticos (corregidos para el rojo y el azul y tienen una mayor apertura numérica) y finalmente los apocromáticos (que son de mayor calidad y están corregidos para el rojo, el azul y el verde).

Aplicaciones del microscopio óptico
Este instrumento ha sido de gran utilidad, sobre todo en los campos de la ciencia en donde la estructura y la organización microscópica es importante, incorporándose con éxito a investigaciones dentro del área de la química (en el estudio de cristales), la física (en la investigación de las propiedades físicas de los materiales), la geología (en el análisis de la composición mineralógica de algunas rocas) y, por supuesto, en el campo de la biología (en el estudio de estructuras microscópicas de la materia viva), por citar algunas disciplinas de la ciencia.
Hasta ahora se da uso en el laboratorio de histología y anatomía patológica, donde la microscopía permite determinadas aplicaciones diagnósticas, entre ellas el diagnóstico de certeza del cáncer, numerosas estructuras cristalinas, pigmentos, lípidos, proteínas, depósitos óseos, depósitos de amiloide, etcétera.

FOTO: Microscopio estereoscópico.
El diseño de este instrumento, también llamado «lupa binocular», es distinto al del diagrama de más arriba y su utilidad es diferente, pues se utiliza para ofrecer una imagen estereoscópica (3D) de la muestra. Para ello, y como ocurre en la visión binocular convencional, es necesario que los dos ojos observen la imagen con ángulos ligeramente distintos. Obviamente todos los microscopios estereoscópicos, por definición, deben ser binoculares (con un ocular para cada ojo), por lo que a veces se confunden ambos términos. Existen dos tipos de diseño, denominados respectivamente convergente (o Greenough) y de objetivo común (o Galileo).
El diseño convergente consiste en usar dos microscopios idénticos inclinados un cierto ángulo uno con respecto a otro y acoplados mecánicamente de tal forma que enfocan la imagen en el mismo punto y con el mismo aumento. Aunque es un diseño económico, potente y en el que las aberraciones resultan muy fáciles de corregir, presenta algunas limitaciones en cuanto a modularidad (capacidad de modificar el sistema para poner accesorios) y la observación durante tiempos largos resulta fatigosa.

El microscopio estereoscópico es apropiado para observar objetos de tamaños relativamente grandes, por lo que no es necesario modificar los objetos a ver, (laminar) ni tampoco lo es que la luz pase a través de la muestra. Este tipo de microscopios permite unas distancias que van desde un par de centímetros a las decenas de ellos desde la muestra al objetivo, lo que lo hace muy útil en botánica, mineralogía y en la industria (microelectrónica, por ejemplo) como en medicina (microscopios quirúrgicos) e investigación, fundamentalmente en aplicaciones que requieren manipular el objeto visualizado (donde la visión estereoscópica es esencial). En la fotografía se aprecia una concha de 4 cm de diámetro.
Podríamos decir que un microscopio estereoscópico sirve para las disecciones de animales.

 

Conectar una cámara digital a un microscopio óptico


FOTO: Adaptador digital LM para la Canon EOS 5D.

Un adaptador óptico mecánico es importante en fotografía digital. Dicho adaptador sirve de enlace entre la cámara y el microscopio. Es especialmente importante que la conexión mecánica sea firme, pues cualquier movimiento mínimo, es decir, vibraciones de la cámara, reduciría la calidad de la imagen notablemente. Adicionalmente, se requiere un adaptador óptico para el trayecto de luz con el que se logrará así que el sensor CCD/CMOS de la cámara proyecte una imagen de total nitidez e iluminación.
La fotomicrografía (fotografía realizada con la ayuda de un microscopio compuesto) es un campo muy especializado de la fotografía, para la que hay disponibles equipos de precio muy elevado, y no simples equipos de estudio.
Con un microscopio de calidad adecuada, como los que se encuentran en la mayoría de los laboratorios científicos, se pueden realizar fotomicrografías de una calidad razonable, utilizando una cámara de uso general, de objetivo fijo o intercambiable.

Métodos básicos

Hay dos métodos básicos de tomar fotografías por medio del microscopio. En el primer método el objetivo de la cámara realiza una función parecida a la del cristalino del ojo y proyecta sobre el sensor una imagen real de la imagen virtual que se ve por el ocular del microscopio. Este método es el único adecuado para utilización de cámaras con objetivo fijo, esto es, no intercambiable.
El segundo método, adecuado para cámaras con objetivo intercambiable, implica retirar el objetivo de la cámara y ajustar el microscopio de modo que el ocular forme una imagen directamente sobre el sensor.
La calidad de la óptica de un microscopio (objetivo y ocular) es fundamental en la determinación de la calidad de una imagen fotográfica. Los objetivos y oculares de microscopio se encuentran en diferentes calidades, determinadas por la precisión con que han sido corregidos de aberraciones. Los objetivos más económicos están corregidos de aberración esférica para un solo color, generalmente el amarillo verdoso, pero no de aberración cromática para la totalidad del espectro visible, sino sólo para dos o tres colores, primarios. Estos objetivos se llaman acromáticos, y también muestran cierta cantidad de curvatura de campo; esto es, que la totalidad del campo de visión del objetivo no puede llevarse simultáneamente a foco fino.
Existen los acromáticos de campo plano, en los que la curvatura de campo ha sido casi totalmente corregida, se denominan planacromáticos.
Los apocromáticos están corregidos de aberración esférica para dos colores y de aberración cromática para los tres colores primarios. Aun así, mostrarán curvatura de campo a menos que sean planapocromáticos, los mejores objetivos de que se dispone. Los oculares también tienen diferentes calidades. Los más simples son los de campo ancho.
Los oculares compensadores se diseñan para compensar ciertas aberraciones cromáticas residuales del objetivo, y dan su mejor resultado cuando se utilizan con objetivos apocromáticos, aunque también pueden utilizarse con éxito con los acromáticos de mayor potencia. Existen los oculares foto, especiales para fotomicrografía, y cuando se utilizan con los objetivos planapocromáticos dan la mejor calidad posible de fotografía.

Desor

El diseño de objetivo común utiliza dos rutas ópticas paralelas (una para cada ojo) que se hacen converger en el mismo punto y con un cierto ángulo con un objetivo común a ambos microscopios. El diseño es más sofisticado que el convergente, con mejor modularidad y no genera fatiga en tiempos de observación largos. Sin embargo es más costoso de fabricar y las aberraciones, al generarse la imagen a través de la periferia del objetivo común y en un ángulo que no coincide con el eje óptico del mismo, son más difíciles de corregir.
Los microscopios estereoscópicos suelen estar dotados, en cualquiera de sus variantes, de un sistema pancrático (zoom) o un sistema de cambiador de aumentos que permite observar la muestra en un rango de aumentos variable, siempre menor que el de un microscopio compuesto.

FOTO: Microscopio compuesto



Objetivos de un microscopio moderno.
Un microscopio compuesto tiene más de un lente objetivo. Los microscopios compuestos se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes, o cortados en láminas tan finas que se transparentan. Se emplea para aumentar o ampliar las imágenes de objetos y organismos no visibles a simple vista. El microscopio óptico común está conformado por tres sistemas:
                      El sistema mecánico está constituido por una palanca que sirve para sostener, elevar y detener los instrumentos a observar.
        El sistema de iluminación comprende un conjunto de instrumentos, dispuestas de tal manera que producen las ranuras de luz.
        El sistema óptico comprende las partes del microscopio que permiten un aumento de los objetos que se pretenden observar mediante filtros llamados "de antigel subsecuente".
 Parte mecánica del microscopio

DIBUJO: Esquema de un micoscopio óptico.

La parte mecánica del microscopio comprende el pie, el tubo, el revólver, el asa, la platina, el carro y el tornillo micrométrico. Estos elementos sostienen la parte óptica y de iluminación; además, permiten los desplazamientos necesarios para el enfoque del objeto.
                      El pie y soporte: Constituye la base sobre la que se apoya el microscopio y tiene por lo general forma de Y o bien es rectangular.
        La columna o brazo:llamada también asa, es una pieza en forma de C, unida a la base por su parte inferior mediante una bisagra, permitiendo la inclinación del tubo para mejorar la captación de luz cuando se utilizan los espejos. Sostiene el tubo en su porción superior y por el extremo inferior se adapta al pie.
        El tubo: tiene forma cilíndrica . El tubo se encuentra en una carretera superior de la columna mediante un sistema de cremalleras, las cuales permiten que el tubo se mueva mediante los tornillos.
        El tornillo macrométrico: girando este tornillo, asciende o desciende el tubo del microscopio, deslizándose en sentido vertical gracias a un mecanismo de cremallera. Estos movimientos largos permiten el enfoque rápido de la preparación.
        El tornillo micrométrico: mediante el ajuste fino con movimiento casi imperceptible que produce al deslizar el tubo o la platina, se logra el enfoque exacto y nítido de la preparación. Lleva acoplado un tambor graduado en divisiones de 0,001 mm., que se utiliza para precisar sus movimientos y puede medir el espesor de los objetos.
        La platina: es una pieza metálica plana en la que se coloca la preparación u objeto que se va a observar. Presenta un orificio, en el eje óptico del tubo, que permite el paso de los rayos luminosos a la preparación. La platina puede ser fija, en cuyo caso permanece inmóvil; en otros casos puede ser giratoria; es decir, mediante tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos circulares.
        Las pinzas: son dos piezas metálicas que sirven para sujetar la preparación. Se encuentran en la platina.
        El revólver: es una pieza giratoria provista de orificios en los que se enroscan los objetivos. Al girar el revólver, los objetivos pasan por el eje del tubo y se colocan en posición de trabajo, lo que se nota por el ruido de un piñón que lo fija.

Sistema óptico

El sistema óptico es el encargado de reproducir y aumentar las imágenes mediante el conjunto de lentes que lo componen. Está formado por el ocular y los objetivos. El objetivo proyecta una imagen de la muestra que el ocular luego amplía.
                      El ocular: se encuentra situado en la parte superior del tubo. Su nombre se debe a la cercanía de la pieza con el ojo del observador. Tiene como función aumentar la imagen formada por el objetivo. Los oculares son intercambiables y sus poderes de aumento van desde 5X hasta 20X. Existen oculares especiales de potencias mayores a 20X y otros que poseen unaescala micrométrica; estos últimos tienen la finalidad de medir el tamaño del objeto observado.
        Los objetivos: se disponen en una pieza giratoria denominada revólver y producen el aumento de las imágenes de los objetos y organismos, y, por tanto, se hallan cerca de la preparación que se examina. Los objetivos utilizados corrientemente son de dos tipos: objetivos secos y objetivos de inmersión.
                      Los objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos y la preparación. En la cara externa llevan una serie de índices que indican el aumento que producen, la abertura numérica y otros datos. Así, por ejemplo, si un objetivo tiene estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que el objetivo es planacromático, su aumento 40 y su apertura numérica 0,65, calculada para una longitud de tubo de 160 mm. El número de objetivos varía con el tipo de microscopio y el uso a que se destina. Los aumentos de los objetivos secos más frecuentemente utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X.
        El objetivo de inmersión está compuesto por un complicado sistema de lentes. Para observar a través de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite de cedro entre el objetivo y la preparación, de manera que la lente frontal entre en contacto con el aceite de cedro. Generalmente, estos objetivos son de 100X y se distingue por uno o dos círculos o anillos de color negro que rodea su extremo inferior.

Sistema de ILuminación

Este sistema tiene como finalidad dirigir la luz natural o artificial de tal manera que ilumine la preparación u objeto que se va a observar en el microscopio de la manera adecuada. Comprende los siguientes elementos:
                      Fuente de iluminación: se trata clásicamente de una lámpara incandescente de tungsteno sobrevoltada; en versiones más modernas con leds. Por delante de ella se sitúa un condensador (una lente convergente) e, idealmente, un diafragma de campo, que permite controlar el diámetro de la parte de la preparación que queda iluminada, para evitar que exceda el campo de observación produciendo luces parásitas.
        El espejo: necesario si la fuente de iluminación no está construida dentro del microscopio y ya alineada con el sistema óptico, como suele ocurrir en los microscopios modernos. Suele tener dos caras: una cóncava y otra plana. Goza de movimientos en todas las direcciones. La cara cóncava se emplea de preferencia con iluminación artificial, y la plana, para natural (luz solar). Los modelos más modernos no poseen espejos sino una lámpara que cumple la misma función que el espejo.
        Condensador: está formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar los rayos luminosos sobre el plano de la preparación, formando un cono de luz con el mismo ángulo que el del campo del objetivo. El condensador se sitúa debajo de la platina y su lente superior es generalmente planoconvexa, quedando la cara superior plana en contacto con la preparación cuando se usan objetivos de gran abertura (los de mayor ampliación); existen condensadores de inmersión, que piden que se llene con aceite el espacio entre esa lente superior y la preparación. La abertura numérica máxima del condensador debe ser al menos igual que la del objetivo empleado, o no se logrará aprovechar todo su poder separador. El condensador puede deslizarse verticalmente sobre un sistema de cremallera mediante un tornillo, bajándose para su uso con objetivos de poca potencia.
        Diafragma: el condensador está provisto de un diafragma-iris, que regula su abertura para ajustarla a la del objetivo. Puede emplearse, de manera irregular, para aumentar el contraste, lo que se hace cerrándolo más de lo que conviene si se quiere aprovechar la resolución del sistema óptico.

Trayectoria del rayo de luz a través del microscopio

El haz luminoso procedente de la lámpara pasa directamente a través del diafragma al condensador. Gracias al sistema de lentes que posee el condensador, la luz es concentrada sobre la preparación a observar. El haz de luz penetra en el objetivo y sigue por el tubo hasta llegar al ocular, donde es captado por el ojo del observador.
Propiedades del microscopio
                      Poder separador. También llamado a veces poder de resolución, es una cualidad del microscopio, y se define como la distancia mínima entre dos puntos próximos que pueden verse separados. El ojo normal no puede ver separados dos puntos cuando su distancia es menor a una décima de milímetro. En el microscopio viene limitado por la longitud de onda de la radiación empleada; en el microscopio óptico, el poder separador máximo conseguido es de 0,2 décimas de micrómetro (la mitad de la longitud de onda de la luz azul), y en el microscopio electrónico, el poder separador llega hasta 10 Å.
        Poder de definición. Se refiere a la nitidez de las imágenes obtenidas, sobre todo respecto a sus contornos. Esta propiedad depende de la calidad y de la corrección de las aberraciones de las lentes utilizadas.
        Ampliación del microscopio. En términos generales se define como la relación entre el diámetro aparente de la imagen y el diámetro o longitud del objeto. Esto quiere decir que si el microscopio aumenta 100 diámetros un objeto, la imagen que estamos viendo es 100 veces mayor linealmente que el tamaño real del objeto (la superficie de la imagen será 1002, es decir 10.000 veces mayor). Para calcular el aumento que está proporcionando un microscopio, basta multiplicar los aumentos respectivos debidos al objetivo y el ocular empleados. Por ejemplo, si estamos utilizando un objetivo de 45X y un ocular de 10X, la ampliación con que estamos viendo la muestra será: 45X x 10X = 450X, lo cual quiere decir que la imagen del objeto está ampliada 450 veces, también expresado como 450 diámetros.

Campo del microscopio

FOTO: Paramecium aurelia.

Microscopio óptico. El mejor conocido de losciliados. Las burbujas que se ven sonvacuolas. Todo el cuerpo está cubierto de cilios, que se ven borrosos debido a sus rápidos movimientos.
Se denomina campo del microscopio al círculo visible que se observa a través del microscopio. También podemos definirlo como la porción del plano visible observado a través del microscopio. Si el aumento es mayor, el campo disminuye, lo cual quiere decir que el campo es inversamente proporcional al aumento del microscopio. Para medir el diámetro del campo del microscopio con cualquiera de los objetivos se utiliza el micrómetro, al que se hará referencia en el siguiente punto.

Tipos de microscopios

Existen diversas clases de microscopios, según la naturaleza de los sistemas de luz, y otros accesorios utilizados para obtener las imágenes.
El microscopio compuesto u óptico utiliza lentes para ampliar las imágenes de los objetos observados. El aumento obtenido con estos microscopios es reducido, debido a la longitud de onda de la luz visible que impone limitaciones. El microscopio óptico puede ser monocular, y consta de un solo tubo. La observación en estos casos se hace con un solo ojo. Es binocular cuando posee dos tubos. La observación se hace con los dos ojos. Esto presenta ventajas tales como mejor percepción de la imagen, más cómoda la observación y se perciben con mayor nitidez los detalles.
Microscopio estereoscópico: el microscopio estereoscópico hace posible la visión tridimensional de los objetos. Consta de dos tubos oculares y dos objetivos pares para cada aumento. Este microscopio ofrece ventajas para observaciones que requieren pequeños aumentos. El óptimo de visión estereoscópica se encuentra entre 2 y 40X o aumento total del microscopio.
Microscopio de campo oscuro. Este microscopio está provisto de un condensador paraboloide, que hace que los rayos luminosos no penetren directamente en el objetivo, sino que iluminan oblicuamente la preparación. Los objetos aparecen como puntos luminosos sobre un fondo oscuro.
Microscopio de fluorescencia. La fluorescencia es la propiedad que tienen algunas sustancias de emitir luz propia cuando inciden sobre ellas radiaciones energéticas. El tratamiento del material biológico con flurocromos facilita la observación al microscopio.
Microscopio de contraste de fases. Se basa en las modificaciones de la trayectoria de los rayos de luz, los cuales producen contrastes notables en la preparación.

 

Microscopio electrónico.

Invención del microscopio electrónico

En 1932, Bruche y Johnsson construyen el primer microscopio electrónico a base de lentes electrostáticas. Ese mismo año Knoll y Ruska dan a conocer los primeros resultados obtenidos con un microscopio electrónico Siemens, construido con lentes magnéticas. Así nace el microscopio electrónico. Para 1936 ya se ha perfeccionado y se fabrican microscopios electrónicos que superan en resolución al microscopio óptico.
Estos logros no sólo representan un avance en el campo de la electrónica, sino también en el campo de la Biología, pues son muchas las estructuras biológicas que se han descubierto y que revelan detalles inusitados, al observarlas al microscopio electrónico.

 

Funcionamiento del microscopio electrónico

El microscopio electrónico utiliza un flujo de electrones en lugar de luz. Consta fundamentalmente de un tubo de rayos catódicos, en el cual debe mantenerse el vacio. El cátodo está constituido por un filamento de tungsteno, que al calentarse eléctricamente emite los electrones, los cuales son atraídos hacia el ánodo por una diferencia de potencial de 50.000 a 100.000 voltios. La lente del condensador enfoca este haz y lo dirige hacia el objeto que se observa, cuya preparación exige técnicas especiales. Los electrones chocan contra la preparación, sobre la cual se desvían de manera desigual.
Se acostumbra a utilizar el término microoscopicos para las fotografías tomadas a través del microscopio óptico y micrografía o electromicrografía para las que se toman en el microscopio electrónico.
Los aumentos máximos conseguidos en el microscopio electrónico son del orden de 2.000.000X mediante el acoplamiento al microscopio electrónico de un amplificador de imagen y una cámara de televisión. En resumen, el microscopio electrónico consta esencialmente de:
                      Un filamento de tungsteno (cátodo) que emite electrones.
        Condensador o lente electromagnética, que concentra el haz de electrones.
        Objetivo o lente electromagnética, que amplía el cono de proyección del haz de luz.
        Ocular o lente electromagnética, que aumenta la imagen.
        Proyector o lente proyectora, que amplía la imagen.
        Pantalla fluorescente, que recoge la imagen para hacerla visible al ojo humano.

Tipos de microscopios electrónicos

Existen varios tipos de microscopios electrónicos, que cada día se perfeccionan más.
El microscopio electrónico de transmisión que utiliza un haz de electrones acelerados por un alto voltaje (cien mil voltios). Este haz ilumina una sección muy fina de la muestra, sean tejidos, células u otro material.
El microscopio electrónico de barrido se utiliza para el estudio de la morfología y la topografía de los elementos. Estos instrumentos utilizan voltajes cercanos a los 20.000 voltios. Las lentes magnéticas utilizan un haz muy fino de electrones para penetrar repetidamente la muestra, y se produce una imagen ampliada de la superficie observada en la pantalla de un monitor. El microscopio electrónico mixto tiene propiedades comunes con el de transmisión y con el de barrido y resulta muy útil para ciertas investigaciones. Hay otros microscopios analíticos que detectan señales características de los elementos que constituyen la muestra.
Con estos poderosos instrumentos, que utilizan el flujo de electrones y las radiaciones electromagnéticas así como la aplicación de técnicas histoquímicas y bioquímicas, además del empleo de marcadores radiactivos, se han logrado grandes avances en la biología celular.

 

Microscopio electrónico de barrido.
El microscopio electrónico de barrido está situado a la izquierda del operador, y las imágenes computarizadas de la muestra se ven en la pantalla de la derecha. Aunque un microscopio electrónico de transmisión puede resolver objetos más pequeños que uno de barrido, este último genera imágenes más útiles para conocer la estructura tridimensional de objetos minúsculos.

 

Microscopio quirúrgico

El empleo de microscopios quirúrgicos ha permitido que los cirujanos lleven a cabo intervenciones que parecían imposibles, como la reimplantación de un miembro y la cirugía de los ojos y oídos. Estos microscopios son en especial útiles cuando es necesario realinear para unir o reparar fibras nerviosas y vasos sanguíneos individuales. Se usa para operaciones dificultosas.

Medición a través del microscopio

Muchas veces interesa al observador conocer el tamaño real de los objetos o microorganismos que está observando a través del microscopio. Para estas mediciones pueden utilizarse varios métodos.
Método de los micrómetros. Se utiliza para esto un micrómetro de platina o de objetivo, que consiste en un portaobjetos en cuyo centro se halla una escala graduada (de 2 mm. de longitud), con separaciones, entre cada división, de una centésima de milímetro.
Además se utiliza un micrómetro ocular que lleva una escala graduada en décimas de milímetros. Se coloca el micrómetro objetivo sobre la platina y se enfoca el microscopio hasta que las líneas de la escala graduada aparezcan nítidas. Luego se hace superponer la escala del ocular y se toma como referencia las primeras divisiones en que una línea del micrómetro objetivo y una línea del micrómetro ocular coincidan o se superpongan exactamente.
Luego, por simple regla de tres, se calcula el valor en mieras de cada división ocular. Veamos un ejemplo. Si 9 divisiones del micrómetro objetivo (0,09mm) equivalen a 30 divisiones del micrómetro ocular, cada división del ocular equivaldrá a: 0,09/30 = 0,003 mm. = 3 µm
Quiere decir que para el objetivo calibrado y el ocular utilizado, cada división del micrómetro ocular equivale a 3 µm. Una vez obtenido este dato para cada objetivo en la forma que hemos expuesto, teniendo el microscopio ocular podrían hacerse todas las mediciones que se deseen. Para medir, por ejemplo, un Paramecium de una preparación, procedemos así: haremos coincidir los extremos del microorganismo con las divisiones del micrómetro ocular. Si la longitud del organismo es de 75 divisiones del micrómetro ocular, y cada división equivale a 3 µm, la longitud del Paramecium será 75x3= 225 µm. También se pueden efectuar mediciones en el microscopio con cámara clara y utilizando una regla. En realidad, estas medidas no son tan exactas como cuando se utilizan micrómetros por errores que se introducen superponiendo imágenes.

Mantenimiento del microscopio

El microscopio debe estar protegido del polvo, humedad y otros agentes que pudieran dañarlo. Mientras no esté en uso debe guardarse en un estuche o gabinete, o bien cubrirlo con una bolsa plástica o campana de vidrio.
Las partes mecánicas deben limpiarse con un paño suave; en algunos casos, éste se puede humedecer con xilol para disolver ciertas manchas de grasa, aceite de cedro, parafina, etc. Que hayan caído sobre las citadas partes.
La limpieza de las partes ópticas requiere precauciones especiales. Para ello debe emplearse papel de óptico que expiden las casas distribuidoras de material de laboratorio ó fotografía o utilizar un paño de algodón. Para el polvillo se puede utilizar un perilla con pincel de pelo de camello. Nunca deben tocarse las lentes del ocular, objetivo y condensador con los dedos; las huellas digitales perjudican la visibilidad, y cuando se secan resulta trabajoso eliminarlas.
Para una buena limpieza de las lentes puede humedecerse el papel de óptica, envolviendo un palillo con algo de punta con una solución de éter/alcohol (70-30 %) y luego pasarlo por la superficie cuantas veces sea necesario. La limpieza de la óptica ha de realizarse en espiral, desde el centro hacia el exterior. El aceite de cedro que queda sobre la lente frontal del objetivo de inmersión debe quitarse inmediatamente después de finalizada la observación. Para ello se puede pasar el papel de óptica impregnado con una gota de xilol. En caso de estar seco debe ponerse la zona a remojo con la solución señalada. Para guardarlo se acostumbra colocar el objetivo de menor aumento sobre la platina y bajado hasta el tope; el condensador debe estar en su posición más baja, para evitar que tropiece con alguno de los objetivos. Guárdese en lugares secos, para evitar que la humedad favorezca la formación de hongos. Ciertos ácidos y otras sustancias químicas que producen emanaciones fuertes, deben mantenerse alejados del microscopio.

Conclusiones

Dos lentes convexas bastan para construir un microscopio. Cada lente hace converger los rayos luminosos que la atraviesan. Una de ellas, llamada objetivo, se sitúa cerca del objeto que se quiere estudiar. El objetivo forma una imagen real aumentada e invertida. Se dice que la imagen es real porque los rayos luminosos pasan realmente por el lugar de la imagen. La imagen es observada por la segunda lente, llamada ocular, que actúa sencillamente como una lupa. El ocular está situado de modo que no forma una segunda imagen real, sino que hace divergir los rayos luminosos, que al entrar en el ojo del observador parecen proceder de una gran imagen invertida situada más allá del objetivo. Como los rayos luminosos no pasan realmente por ese lugar, se dice que la imagen es virtual.


microscopio de 1852

Cronología del desarrollo del microscopio
                      1590: con posterioridad, algunos autores (Pierre Borel 1620 - 1671 o 1628 - 1689 y Willem Boreel 1591 - 1668) reivindican que en esta fecha los fabricantes holandeses de anteojos, Hans Janssen y su hijo Zacharias Janssen inventaron un microscopio compuesto, pero este hecho no se ha podido verificar.
        1609: Galileo Galilei desarrolla un occhiolino o microscopio compuesto de una lente convexa y una cóncava.
        1612: Galileo presenta el occhiolino al rey de Polonia Segismundo III.
        1619: Cornelius Drebbel (1572 - 1633) presenta en Londres, un microscopio compuesto de dos lentes convexas.
        c.1622: Drebbel presenta su invento en Roma.
        1624: Galileo presenta su occhiolino al Príncipe Federico Cesi, fundador de la Academia de los Linces).
        1625: Giovanni Faber de Bamberg (1574 - 1629), miembro de la Academia de los Linces, acuña la palabra microscopio por analogía contelescopio.
        1665: Robert Hooke publica Micrographia, una colección de micrografías biológicas. Acuña la palabra célula para las estructuras que descubre en una corteza de corcho.
        1674: Anton van Leeuwenhoek inventa el microscopio simple.
        1931: Ernst Ruska y Max Knoll construyen el primer microscopio electrónico.
        1965: se desarrolla el primer microscopio electrónico de barrido.
        1981: Gerd Binnig y Heinrich Rohrer desarrollan el microscopio de efecto túnel.
        1985 Binnig y Rohrer desarrollan el microscopio de fuerza atómica.

AUMENTOS

El ocular normalmente tiene un aumento de 10x (la "x" indica "aumento") por lo que amplifica una imagen 10 veces su tamaño normal.
En cuanto a los objetivos, por lo común tienen un aumento que varía entre 4x a 45x. Lo normal es encontrar tres objetivos de distinto aumento (4x, 10x y 40x) montados sobre una base giratoria que permite intercambiarlos para aumentar, en forma creciente, el tamaño de la imagen. Una propiedad importante de los objetivos es que normalmente invierten la imagen en todo sentido (de derecha a izquierda y de arriba abajo) y, como el ocular no puede reinvertirla, nosotros la observamos completamente al revés. Esto no es un problema porque ¿quién sabe qué es arriba y qué abajo en una célula? pero conviene tenerlo en cuenta porque cuando movemos el preparado, la imagen se desplaza ante nuestros ojos en sentido contrario a lo que esperaríamos!!!.
La imagen resultante estará ampliada tantas veces como el producto de las lentes con las que estoy observando, es decir que si utilizo un ocular de 10x y un objetivo de 4x, veré la imagen cuarenta veces más grande que su tamaño original.
Conviene destacar que existen dos tipos de objetivos: los de observación en seco y los de inmersión. En el primer caso, el aumento varía de 4x a 45x y alcanza con el índice de refracción del aire (de ahí el nombre "en seco", por el aire!) para que la imagen se forme nítidamente, pero en el segundo caso, al incrementar el aumento (las lentes de inmersión tienen aumentos de 90x o 100x) es necesario aumentar el índice de refracción entre el preparado y la lente para lograr la imagen, para esto se utilizan aceites de cedro o sintético y la lente se "sumerge" en ellos (de ahí el nombre "de inmersión").









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