Microscopio
Cristales
de nieve vistos con unmicroscopio electrónico de barrido y coloreados
artificialmente.
El microscopio (de micro-, μικρο, pequeño, y scopio, σκοπεω, observar) es un
instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeños para ser
vistos a simple vista. El tipo más común y el primero que se inventó es el
microscopio óptico. Se trata de un instrumento óptico que contiene dos o más
lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por
refracción. La ciencia que investiga los objetos pequeños
utilizando este instrumento se llama microscopía.
Microscopio compuesto fabricado hacia1751 por Magny.
Proviene del laboratorio del duque de Chaulnes y pertenece al Museo
de Artes y +Oficios, París
El microscopio fue
inventado hacia los años 1610, según los italianos, o por Zacharias
Janssen en 1590, en opinión de los holandeses. En 1665 aparece en la obra
de William Harvey sobre la circulación sanguínea al
observar al microscopio los capilares sanguíneos y Robert Hooke publica
su obra Micrographia.
En 1665 Robert
Hooke observó con un microscopio un delgado corte de corcho y
notó que el material era poroso, en su conjunto, formaban cavidades poco
profundas a modo de celditas a las que llamó células. Se trataba de la primera observación de células muertas.
Unos años más tarde, Marcello Malpighi, anatomista y biólogo italiano,
observó células vivas. Fue el primero en estudiar tejidos vivos al microscopio.
A mediados
del siglo XVII un holandés, Anton van Leeuwenhoek, utilizando
microscopios simples de fabricación propia, describió por primera vezprotozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos
rojos. El microscopista Leeuwenhoek, sin ninguna preparación científica, puede
considerarse el fundador de la bacteriología. Tallaba él mismo sus lupas,
sobre pequeñas esferas de cristal, cuyos diámetros no alcanzaban el milímetro
(su campo de visión era muy limitado, de décimas de milímetro). Con estas
pequeñas distancias focales alcanzaba los 275 aumentos. Observó los glóbulos de
la sangre, las bacterias y los protozoos; examinó por primera vez los glóbulos
rojos y descubrió que el semen contiene espermatozoides. Durante su
vida no reveló sus métodos secretos y a su muerte, en 1723, 26 de sus
aparatos fueron cedidos a la Royal Society de Londres.
Durante el siglo XVIII
continuó el progreso y se lograron objetivos acromáticos por asociación
de Chris Neros y Flint Crown obtenidos en 1740 porH. M.
Hall y mejorados por John Dollond. De esta época son los estudios
efectuados por Isaac Newton y Leonhard Euler. En el siglo XIX,
al descubrirse que la dispersión y la refracción se podían
modificar con combinaciones adecuadas de dos o más medios ópticos, se lanzan al
mercado objetivos acromáticos excelentes.
Durante
el siglo XVIII el microscopio tuvo diversos adelantos mecánicos que
aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso, aunque no se desarrollaron por
el momento mejoras ópticas. Las mejoras más importantes de la óptica surgieron
en 1877, cuando Ernst Abbe publicó su teoría del
microscopio y, por encargo de Carl Zeiss, mejoró la microscopía de
inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro, lo que permite obtener
aumentos de 2000. A principios de los años 1930 se había alcanzado el
límite teórico para los microscopios ópticos, no consiguiendo éstos aumentos
superiores a 500X o 1,000X. Sin embargo, existía un deseo científico de
observar los detalles de estructuras celulares (núcleo, mitocondria, etc.).
El microscopio
electrónico de transmisión (TEM) fue el primer tipo de microscopio
electrónico desarrollado. Utiliza un haz de electrones en lugar de luz
para enfocar la muestra consiguiendo aumentos de 100.000X. Fue desarrollado
por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en 1931.
Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrónico de
barrido (SEM).
Tipos de microscopios
Microscopio electrónico de barrido.
•
Microscopio óptico
•
Microscopio simple
•
Microscopio compuesto
•
Microscopio de luz ultravioleta
•
Microscopio de fluorescencia
•
Microscopio petrográfico
•
Microscopio en campo oscuro
•
Microscopio de contraste de fase
•
Microscopio de luz polarizada
•
Microscopio confocal
•
Microscopio electrónico
•
Microscopio electrónico de transmisión
•
Microscopio electrónico de barrido
•
Microscopio de iones en campo
•
Microscopio de sonda de barrido
•
Microscopio de efecto túnel
•
Microscopio de fuerza atómica
•
Microscopio virtual
•
Microscopio de antimateria
•
Microscopio reflector
•
Microscopio telegramatico
•
Microscopio nuclear
Descripción:A) ocular, B) objetivo, C) portador del objeto, D)
lentes de la iluminación, E)
sujeción del objeto, F) espejo
de la iluminación.
Un microscopio óptico es un microscopio basado
en lentes ópticos. También se le conoce como microscopio de luz, (que utiliza luz o
"fotones") o microscopio
de campo claro. El desarrollo de este aparato suele asociarse con los
trabajos de Anton van Leeuwenhoek. Los microscopios de Leeuwenhoek
constaban de una única lente pequeña y convexa, montada sobre una plancha,
con un mecanismo para sujetar el material que se iba a examinar (la muestra o
espécimen). Este uso de una única lente convexa se conoce como [da], en el que
se incluye la lupa, entre otros aparatos ópticos.
Historia
•
1608 Zacharias Jansen construye un microscopio
con dos lentes convergentes.
•
1611 Kepler sugiere la manera de fabricar un
microscopio compuesto.
•
1665 Robert Hooke utiliza un microscopio
compuesto para estudiar cortes de corcho y describe los pequeños
poros en forma de caja a los que él llamó "células". Publica su libro
Micrographia.
•
1674 Leeuwenhoek informa su descubrimiento de
protozoarios. Observará bacterias por primera vez 9 años después.
•
1828 W. Nicol desarrolla la microscopía con luz
polarizada.
•
1838 Schleiden y Schwann proponen la
teoría de la célula y declaran que la célula nucleada es la unidad
estructural y funcional en plantas y animales.
•
1849 J. Quekett publica un tratado práctico sobre el uso
del microscopio.
•
1876 Abbé analiza los efectos de la difracción en
la formación de la imagen en el microscopio y muestra cómo perfeccionar el
diseño del microscopio.
•
1881 Retzius describe gran número de tejidos animales
con un detalle que no ha sido superado por ningún otro microscopista de luz.
En las siguientes dos décadas él, Cajal y otroshistólogos desarrollan
nuevos métodos de tinción y ponen los fundamentos de la anatomía microscópica.
•
1886 Carl Zeiss fabrica una serie de lentes,
diseño de Abbé que permiten al microscopista resolver estructuras en los
límites teóricos de la luz visible.
•
1908 Köhler y Siedentopf desarrollan el microscopio
de fluorescencia.
•
1930 Lebedeff diseña y construye el primer microscopio
de interferencia.
•
1932 Zernike inventa el microscopio de contraste de
fases.
•
1937 Ernst Ruska y Max Knoll, físicos
alemanes, construyen el primer microscopio electrónico.
•
1952 Nomarski inventa y patenta el sistema de contraste
de interferencia diferencial para el microscopio de luz.
Partes del microscopio óptico y sus funciones
1 * Ocular: lente situada cerca del
ojo del observador. Capta y amplía la imagen formada en los objetivos.
2 * Objetivo: lente situada cerca del
revolver. Amplía la imagen, es un elemento vital que permite ver a través de
los oculares
3 * Condensador: lente que concentra
los rayos luminosos sobre la preparación.
4 * Diafragma: regula la cantidad de
luz que llega al condensador.
5 * Foco: dirige los rayos luminosos
hacia el condensador.
6 * Tubo: es una cámara oscura unida
al brazo mediante una cremallera.
7 * Revólver: Es un sistema que agarra
los objetivos, y que rota para utilizar un objetivo u otro
8 * Tornillos macro y micrométrico: Son
tornillos de enfoque, mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El
macrométrico lo hace de forma rápida y el micrométrico de forma lenta. Llevan
incorporado un mando de bloqueo que fija la platina a una determinada altura.
9 * Platina: Es una plataforma
horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparación, que
permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminación situada
por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y
un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento permite
mover la preparación de delante hacia atrás o de izquierda a derecha y
viceversa.
10 * Base: Es la parte inferior del
microscopio que permite el sostén del mismo.
Sistema de
iluminación
La fuente de luz (1),
con la ayuda de una lente (o sistema) (2), llamada colector, se representa en
el plano del diafragma iris de abertura (5) del condensador (6). Este
diagrama se instala en el plano focal anterior del condensador (6) y puede
variar su abertura numérica. El diagrama iris (3) dispuesto junto al colector
(2) es el diafragma de campo. La variación del diámetro del diafragma de campo
permite obtener su imagen igual al campo visual lineal del microscopio. La
abertura numérica del condensador (6) supera, generalmente la de la abertura
del objetivo microscópico. es la iluminacion que permite ver mejor lo que
queremos observar como las células o las membranas celulares entre
otros
Microscopio
compuesto.
Un microscopio
compuesto es un microscopio óptico con más de un lente. Se utilizan
especialmente para examinar objetos transparentes, o cortados en láminas tan
finas que se transparentan.
Principales elementos de un microscopio
básico
Diagrama simple de la óptica de un microscopio.
Los
microscopios de este tipo suelen ser más complejos, con varias lentes en el
objetivo como en el ocular. El objetivo de éstas lentes es el de reducir
la aberración cromática y la aberración esférica. En los
microscopios modernos el espejo se sustituye por una lámpara que ofrece una
iluminación estable y controlable.
Los
microscopios compuestos se utilizan para estudiar especímenes delgados, puesto
que suprofundidad de campo es muy limitada. Por lo general, se utilizan
para examinar cultivos, preparaciones trituradas o una lámina muy fina del
material que sea. Normalmente depende de la luz que atraviese la
muestra desde abajo y usualmente son necesarias técnicas especiales para
aumentar el contraste de la imagen.
La resolución
de los microscopios ópticos está restringida por un fenómeno llamado difracción que,
dependiendo de laapertura numérica (AN) del sistema óptico y la longitud
de onda de la luz utilizada (longitud de onda), establece un
límite definido (d) a la resolución óptica. Suponiendo que las
aberraciones ópticas fueran despreciables, la resolución sería:
Normalmente,
se supone una longitud de onda de 550 nm, correspondiente a la
luz verde. Si el medio es el aire, la AN práctica máxima es
de 0,95, y en el caso de aceite de hasta 1,5.
Ello implica
que incluso el mejor microscopio óptico está limitado a una resolución de unos
0,2 micrómetros.
Poder separador, objetivos de inmersión y
aumento útil
•
Poder separador
•
De la teoría
de la difracción sobre la formación de imágenes mediante un microscopio se
obtiene que la distancia mínima entre dos puntos visibles por separado es:
Donde λ es
la longitud de onda de la luz monocromática en la que se
observa el objeto y A es la abertura del microscopio.
•
Objetivos de
inmersión
El medio
óptico líquido que rellena el espacio entre el objeto y el objetivo se le
denomina líquido de inmersión. El índice de refracción de este
es próximo al del vidrio (se utiliza agua, glicerina,aceites
de cedro y de enebro, monobromonaftalina, entre otros).1
Correcciones
•
Tipos de
objetivos y sus características.
Aunque todos
los componentes que constituyen un microscopio son importantes, los objetivos
son de suma importancia, puesto que la imagen, en definitiva, depende en gran
medida de su calidad. Los mejores objetivos son aquellos que están corregidos
para las aberraciones.
Las aberraciones
Son
alteraciones ópticas en la formación de la imagen debidas a las propias lentes
del objetivo.
•
aberraciones cromáticas
Corrección de las aberraciones
Para evitar las
aberraciones geométricas se construyen los llamados objetivos planos o
planáticos, lo cual suele estar indicado en el propio objetivo con la
inscripción PLAN. Los objetivos que están corregidos para las aberraciones
cromáticas se denominan acromáticos (corregidos para el rojo y el azul),
semiapocromáticos (corregidos para el rojo y el azul y tienen una mayor
apertura numérica) y finalmente los apocromáticos (que son de mayor calidad y
están corregidos para el rojo, el azul y el verde).
Este
instrumento ha sido de gran utilidad, sobre todo en los campos de la ciencia en
donde la estructura y la organización microscópica es importante,
incorporándose con éxito a investigaciones dentro del área de la química (en el
estudio de cristales), la física (en la investigación de las propiedades
físicas de los materiales), la geología (en el análisis de la composición
mineralógica de algunas rocas) y, por supuesto, en el campo de la biología (en
el estudio de estructuras microscópicas de la materia viva), por citar algunas
disciplinas de la ciencia.
Hasta ahora se da uso
en el laboratorio de histología y anatomía patológica, donde la
microscopía permite determinadas aplicaciones diagnósticas, entre ellas el
diagnóstico de certeza del cáncer, numerosas estructuras cristalinas,
pigmentos, lípidos, proteínas, depósitos óseos, depósitos de amiloide,
etcétera.
FOTO: Microscopio estereoscópico.
El diseño de
este instrumento, también llamado «lupa binocular», es distinto al del diagrama
de más arriba y su utilidad es diferente, pues se utiliza para ofrecer
una imagen estereoscópica (3D) de la muestra. Para ello, y como
ocurre en la visión binocular convencional, es necesario que los dos
ojos observen la imagen con ángulos ligeramente distintos. Obviamente todos los
microscopios estereoscópicos, por definición, deben ser binoculares (con un
ocular para cada ojo), por lo que a veces se confunden ambos términos. Existen
dos tipos de diseño, denominados respectivamente convergente (o
Greenough) y de objetivo común (o Galileo).
El diseño
convergente consiste en usar dos microscopios idénticos inclinados un cierto
ángulo uno con respecto a otro y acoplados mecánicamente de tal forma que
enfocan la imagen en el mismo punto y con el mismo aumento. Aunque es un diseño
económico, potente y en el que las aberraciones resultan muy fáciles de
corregir, presenta algunas limitaciones en cuanto a modularidad (capacidad
de modificar el sistema para poner accesorios) y la observación durante tiempos
largos resulta fatigosa.
El microscopio
estereoscópico es apropiado para observar objetos de tamaños relativamente
grandes, por lo que no es necesario modificar los objetos a ver, (laminar) ni
tampoco lo es que la luz pase a través de la muestra. Este tipo de microscopios
permite unas distancias que van desde un par de centímetros a las decenas de
ellos desde la muestra al objetivo, lo que lo hace muy útil en botánica, mineralogía y
en la industria (microelectrónica, por ejemplo) como en medicina (microscopios
quirúrgicos) e investigación, fundamentalmente en aplicaciones que requieren
manipular el objeto visualizado (donde la visión estereoscópica es esencial).
En la fotografía se aprecia una concha de 4 cm de diámetro.
Podríamos
decir que un microscopio estereoscópico sirve para las disecciones de
animales.
Conectar una cámara digital a un microscopio óptico
FOTO:
Adaptador digital LM para la Canon EOS 5D.
Un adaptador
óptico mecánico es importante en fotografía digital. Dicho adaptador sirve
de enlace entre la cámara y el microscopio. Es especialmente importante que la
conexión mecánica sea firme, pues cualquier movimiento mínimo, es decir,
vibraciones de la cámara, reduciría la calidad de la imagen notablemente.
Adicionalmente, se requiere un adaptador óptico para el trayecto de luz con el
que se logrará así que el sensor CCD/CMOS de la cámara proyecte una imagen de
total nitidez e iluminación.
La
fotomicrografía (fotografía realizada con la ayuda de un microscopio compuesto)
es un campo muy especializado de la fotografía, para la que hay disponibles
equipos de precio muy elevado, y no simples equipos de estudio.
Con un
microscopio de calidad adecuada, como los que se encuentran en la mayoría de
los laboratorios científicos, se pueden realizar fotomicrografías de
una calidad razonable, utilizando una cámara de uso general, de objetivo fijo o
intercambiable.
Métodos básicos
Hay dos
métodos básicos de tomar fotografías por medio del microscopio. En el primer
método el objetivo de la cámara realiza una función parecida a la del cristalino del ojo y
proyecta sobre el sensor una imagen real de la imagen virtual que se ve por el
ocular del microscopio. Este método es el único adecuado para utilización de
cámaras con objetivo fijo, esto es, no intercambiable.
El segundo
método, adecuado para cámaras con objetivo intercambiable, implica retirar el
objetivo de la cámara y ajustar el microscopio de modo que el ocular forme una
imagen directamente sobre el sensor.
La calidad de
la óptica de un microscopio (objetivo y ocular) es fundamental en la
determinación de la calidad de una imagen fotográfica. Los objetivos y oculares
de microscopio se encuentran en diferentes calidades, determinadas por la precisión con
que han sido corregidos de aberraciones. Los objetivos más económicos están
corregidos de aberración esférica para un solo color, generalmente el amarillo
verdoso, pero no de aberración cromática para la totalidad del espectro
visible, sino sólo para dos o tres colores, primarios. Estos objetivos se
llaman acromáticos, y también muestran cierta cantidad de curvatura de
campo; esto es, que la totalidad del campo de visión del objetivo no puede
llevarse simultáneamente a foco fino.
Existen los
acromáticos de campo plano, en los que la curvatura de campo ha sido casi
totalmente corregida, se denominan planacromáticos.
Los
apocromáticos están corregidos de aberración esférica para dos
colores y de aberración cromática para los tres colores primarios.
Aun así, mostrarán curvatura de campo a menos que sean planapocromáticos, los
mejores objetivos de que se dispone. Los oculares también tienen diferentes
calidades. Los más simples son los de campo ancho.
Los oculares
compensadores se diseñan para compensar ciertas aberraciones cromáticas
residuales del objetivo, y dan su mejor resultado cuando se utilizan con
objetivos apocromáticos, aunque también pueden utilizarse con éxito con los
acromáticos de mayor potencia. Existen los oculares foto, especiales para
fotomicrografía, y cuando se utilizan con los objetivos planapocromáticos dan
la mejor calidad posible de fotografía.
Desor
El diseño de
objetivo común utiliza dos rutas ópticas paralelas (una para cada ojo) que se
hacen converger en el mismo punto y con un cierto ángulo con un objetivo común
a ambos microscopios. El diseño es más sofisticado que el convergente, con
mejor modularidad y no genera fatiga en tiempos de observación largos. Sin
embargo es más costoso de fabricar y las aberraciones, al generarse la imagen a
través de la periferia del objetivo común y en un ángulo que no coincide con el
eje óptico del mismo, son más difíciles de corregir.
Los
microscopios estereoscópicos suelen estar dotados, en cualquiera de sus
variantes, de un sistema pancrático (zoom) o un sistema de cambiador de
aumentos que permite observar la muestra en un rango de aumentos variable,
siempre menor que el de un microscopio compuesto.
FOTO: Microscopio compuesto
Objetivos
de un microscopio moderno.
Un microscopio compuesto tiene más de
un lente objetivo. Los microscopios compuestos se utilizan especialmente
para examinar objetos transparentes, o cortados en láminas tan finas que se
transparentan. Se emplea para aumentar o ampliar las imágenes de objetos y
organismos no visibles a simple vista. El microscopio óptico común está
conformado por tres sistemas:
•
El sistema mecánico está constituido por una palanca que
sirve para sostener, elevar y detener los instrumentos a observar.
•
El sistema de iluminación comprende un conjunto de
instrumentos, dispuestas de tal manera que producen las ranuras de luz.
•
El sistema óptico comprende las partes del microscopio
que permiten un aumento de los objetos que se pretenden observar mediante
filtros llamados "de antigel subsecuente".
Parte mecánica del microscopio
DIBUJO: Esquema de un micoscopio óptico.
La parte mecánica del
microscopio comprende el pie, el tubo, el revólver, el asa, la platina, el
carro y el tornillo micrométrico. Estos elementos sostienen la parte óptica y
de iluminación; además, permiten los desplazamientos necesarios para el enfoque
del objeto.
•
El pie y
soporte: Constituye la base sobre la que se apoya el microscopio y tiene por
lo general forma de Y o bien es rectangular.
•
La columna o
brazo:llamada también asa, es una pieza en forma de C, unida a la base por su
parte inferior mediante una bisagra, permitiendo la inclinación del tubo
para mejorar la captación de luz cuando se utilizan los espejos.
Sostiene el tubo en su porción superior y por el extremo inferior se adapta al
pie.
•
El tubo: tiene
forma cilíndrica . El tubo se encuentra en una carretera superior de la columna
mediante un sistema de cremalleras, las cuales permiten que el tubo se mueva
mediante los tornillos.
•
El tornillo
macrométrico: girando este tornillo, asciende o desciende el tubo
del microscopio, deslizándose en sentido vertical gracias a un mecanismo de
cremallera. Estos movimientos largos permiten el enfoque rápido de la
preparación.
•
El tornillo
micrométrico: mediante el ajuste fino con movimiento casi
imperceptible que produce al deslizar el tubo o la platina, se logra el enfoque
exacto y nítido de la preparación. Lleva acoplado un tambor graduado en
divisiones de 0,001 mm., que se utiliza para precisar sus movimientos y puede
medir el espesor de los objetos.
•
La platina: es una
pieza metálica plana en la que se coloca la preparación u objeto que se va a
observar. Presenta un orificio, en el eje óptico del tubo, que permite el paso
de los rayos luminosos a la preparación. La platina puede ser fija, en cuyo
caso permanece inmóvil; en otros casos puede ser giratoria; es decir, mediante
tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos circulares.
•
Las pinzas: son dos
piezas metálicas que sirven para sujetar la preparación. Se encuentran en la
platina.
•
El revólver: es una
pieza giratoria provista de orificios en los que se enroscan los objetivos. Al
girar el revólver, los objetivos pasan por el eje del tubo y se colocan en
posición de trabajo, lo que se nota por el ruido de un piñón que lo fija.
Sistema óptico
El sistema
óptico es el encargado de reproducir y aumentar las imágenes mediante el
conjunto de lentes que lo componen. Está formado por el ocular y los objetivos.
El objetivo proyecta una imagen de la muestra que el ocular luego amplía.
•
El ocular: se
encuentra situado en la parte superior del tubo. Su nombre se debe a la
cercanía de la pieza con el ojo del observador. Tiene como función
aumentar la imagen formada por el objetivo. Los oculares son intercambiables y
sus poderes de aumento van desde 5X hasta 20X. Existen oculares especiales de
potencias mayores a 20X y otros que poseen unaescala micrométrica; estos
últimos tienen la finalidad de medir el tamaño del objeto observado.
•
Los objetivos: se
disponen en una pieza giratoria denominada revólver y producen el aumento de
las imágenes de los objetos y organismos, y, por tanto, se hallan cerca de la
preparación que se examina. Los objetivos utilizados corrientemente son de dos
tipos: objetivos secos y objetivos de inmersión.
•
Los objetivos
secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre
ellos y la preparación. En la cara externa llevan una serie de índices que
indican el aumento que producen, la abertura numérica y otros datos. Así, por
ejemplo, si un objetivo tiene estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa
que el objetivo es planacromático, su aumento 40 y su apertura numérica 0,65,
calculada para una longitud de tubo de 160 mm. El número de objetivos varía con
el tipo de microscopio y el uso a que se destina. Los aumentos de los objetivos
secos más frecuentemente utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X.
•
El objetivo
de inmersión está compuesto por un complicado sistema de lentes. Para
observar a través de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite de
cedro entre el objetivo y la preparación, de manera que la lente frontal entre
en contacto con el aceite de cedro. Generalmente, estos objetivos son de 100X y
se distingue por uno o dos círculos o anillos de color negro que rodea su
extremo inferior.
Sistema de ILuminación
Este sistema
tiene como finalidad dirigir la luz natural o artificial de tal manera que
ilumine la preparación u objeto que se va a observar en el microscopio de la
manera adecuada. Comprende los siguientes elementos:
•
Fuente de
iluminación: se trata clásicamente de una lámpara incandescente
de tungsteno sobrevoltada; en versiones más modernas con leds. Por delante
de ella se sitúa un condensador (una lente convergente) e, idealmente, un
diafragma de campo, que permite controlar el diámetro de la parte de la
preparación que queda iluminada, para evitar que exceda el campo de observación
produciendo luces parásitas.
•
El espejo: necesario
si la fuente de iluminación no está construida dentro del microscopio y ya
alineada con el sistema óptico, como suele ocurrir en los microscopios
modernos. Suele tener dos caras: una cóncava y otra plana. Goza de movimientos
en todas las direcciones. La cara cóncava se emplea de preferencia con
iluminación artificial, y la plana, para natural (luz solar). Los modelos más
modernos no poseen espejos sino una lámpara que cumple la misma
función que el espejo.
•
Condensador: está
formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar los rayos
luminosos sobre el plano de la preparación, formando un cono de luz con el
mismo ángulo que el del campo del objetivo. El condensador se sitúa debajo de
la platina y su lente superior es generalmente planoconvexa, quedando la cara
superior plana en contacto con la preparación cuando se usan objetivos de gran
abertura (los de mayor ampliación); existen condensadores de inmersión, que
piden que se llene con aceite el espacio entre esa lente superior y la
preparación. La abertura numérica máxima del condensador debe ser al menos
igual que la del objetivo empleado, o no se logrará aprovechar todo su poder
separador. El condensador puede deslizarse verticalmente sobre un sistema de
cremallera mediante un tornillo, bajándose para su uso con objetivos de poca
potencia.
•
Diafragma: el
condensador está provisto de un diafragma-iris, que regula su abertura para
ajustarla a la del objetivo. Puede emplearse, de manera irregular, para
aumentar el contraste, lo que se hace cerrándolo más de lo que conviene si se
quiere aprovechar la resolución del sistema óptico.
Trayectoria del rayo de luz a través del
microscopio
El haz
luminoso procedente de la lámpara pasa directamente a través del diafragma al
condensador. Gracias al sistema de lentes que posee el condensador, la luz es
concentrada sobre la preparación a observar. El haz de luz penetra en el
objetivo y sigue por el tubo hasta llegar al ocular, donde es captado por el
ojo del observador.
Propiedades del microscopio
•
Poder separador. También llamado a veces poder de
resolución, es una cualidad del microscopio, y se define como la distancia
mínima entre dos puntos próximos que pueden verse separados. El ojo normal no puede
ver separados dos puntos cuando su distancia es menor a una décima de
milímetro. En el microscopio viene limitado por la longitud de onda de la
radiación empleada; en el microscopio óptico, el poder separador máximo
conseguido es de 0,2 décimas de micrómetro (la mitad de la longitud de onda de
la luz azul), y en el microscopio electrónico, el poder separador llega hasta
10 Å.
•
Poder de definición. Se refiere a la nitidez de las
imágenes obtenidas, sobre todo respecto a sus contornos. Esta propiedad depende
de la calidad y de la corrección de las aberraciones de las lentes utilizadas.
•
Ampliación del microscopio. En términos generales se
define como la relación entre el diámetro aparente de la imagen y el diámetro o
longitud del objeto. Esto quiere decir que si el microscopio aumenta 100
diámetros un objeto, la imagen que estamos viendo es 100 veces mayor
linealmente que el tamaño real del objeto (la superficie de la imagen será
1002, es decir 10.000 veces mayor). Para calcular el aumento que está proporcionando
un microscopio, basta multiplicar los aumentos respectivos debidos al objetivo
y el ocular empleados. Por ejemplo, si estamos utilizando un objetivo de 45X y
un ocular de 10X, la ampliación con que estamos viendo la muestra será: 45X x
10X = 450X, lo cual quiere decir que la imagen del objeto está ampliada 450
veces, también expresado como 450 diámetros.
Campo del microscopio
FOTO:
Paramecium aurelia.
Microscopio óptico. El mejor conocido de losciliados. Las burbujas que se
ven sonvacuolas. Todo el cuerpo está cubierto de cilios, que se ven borrosos
debido a sus rápidos movimientos.
Se denomina
campo del microscopio al círculo visible que se observa a través del
microscopio. También podemos definirlo como la porción del plano visible
observado a través del microscopio. Si el aumento es mayor, el campo disminuye,
lo cual quiere decir que el campo es inversamente proporcional al aumento del
microscopio. Para medir el diámetro del campo del microscopio con cualquiera de
los objetivos se utiliza el micrómetro, al que se hará referencia en el
siguiente punto.
Tipos de microscopios
Existen
diversas clases de microscopios, según la naturaleza de los sistemas de luz, y
otros accesorios utilizados para obtener las imágenes.
El microscopio compuesto u óptico utiliza
lentes para ampliar las imágenes de los objetos observados. El aumento obtenido
con estos microscopios es reducido, debido a la longitud de onda de la luz
visible que impone limitaciones. El microscopio óptico puede ser monocular, y
consta de un solo tubo. La observación en estos casos se hace con un solo ojo.
Es binocular cuando posee dos tubos. La observación se hace con los dos ojos.
Esto presenta ventajas tales como mejor percepción de la imagen, más cómoda la
observación y se perciben con mayor nitidez los detalles.
Microscopio estereoscópico: el
microscopio estereoscópico hace posible la visión tridimensional de los
objetos. Consta de dos tubos oculares y dos objetivos pares para cada aumento.
Este microscopio ofrece ventajas para observaciones que requieren pequeños
aumentos. El óptimo de visión estereoscópica se encuentra entre 2 y 40X o
aumento total del microscopio.
Microscopio de campo oscuro. Este
microscopio está provisto de un condensador paraboloide, que hace que los rayos
luminosos no penetren directamente en el objetivo, sino que iluminan
oblicuamente la preparación. Los objetos aparecen como puntos luminosos sobre
un fondo oscuro.
Microscopio de fluorescencia. La
fluorescencia es la propiedad que tienen algunas sustancias de emitir luz
propia cuando inciden sobre ellas radiaciones energéticas. El tratamiento del
material biológico con flurocromos facilita la observación al microscopio.
Microscopio de contraste de fases. Se basa en
las modificaciones de la trayectoria de los rayos de luz, los cuales producen
contrastes notables en la preparación.
Microscopio
electrónico.
Invención del microscopio electrónico
En 1932,
Bruche y Johnsson construyen el primer microscopio electrónico a base de lentes
electrostáticas. Ese mismo año Knoll y Ruska dan a conocer los primeros
resultados obtenidos con un microscopio electrónico Siemens, construido con
lentes magnéticas. Así nace el microscopio electrónico. Para 1936 ya se ha
perfeccionado y se fabrican microscopios electrónicos que superan en resolución
al microscopio óptico.
Estos logros
no sólo representan un avance en el campo de la electrónica, sino también en el
campo de la Biología, pues son muchas las estructuras biológicas que se han
descubierto y que revelan detalles inusitados, al observarlas al microscopio
electrónico.
Funcionamiento del microscopio electrónico
El microscopio
electrónico utiliza un flujo de electrones en lugar de luz. Consta
fundamentalmente de un tubo de rayos catódicos, en el cual debe mantenerse el
vacio. El cátodo está constituido por un filamento de tungsteno, que al
calentarse eléctricamente emite los electrones, los cuales son atraídos hacia
el ánodo por una diferencia de potencial de 50.000 a 100.000 voltios. La lente
del condensador enfoca este haz y lo dirige hacia el objeto que se observa,
cuya preparación exige técnicas especiales. Los electrones chocan contra la
preparación, sobre la cual se desvían de manera desigual.
Se acostumbra
a utilizar el término microoscopicos para las fotografías tomadas a través del
microscopio óptico y micrografía o electromicrografía para las que se toman en
el microscopio electrónico.
Los aumentos
máximos conseguidos en el microscopio electrónico son del orden de 2.000.000X
mediante el acoplamiento al microscopio electrónico de un amplificador de
imagen y una cámara de televisión. En resumen, el microscopio electrónico
consta esencialmente de:
•
Un filamento de tungsteno (cátodo) que emite
electrones.
•
Condensador o lente electromagnética, que
concentra el haz de electrones.
•
Objetivo o lente electromagnética, que amplía el cono de
proyección del haz de luz.
•
Ocular o lente electromagnética, que aumenta la imagen.
•
Proyector o lente proyectora, que amplía la imagen.
•
Pantalla fluorescente, que recoge la imagen para hacerla
visible al ojo humano.
Tipos de microscopios electrónicos
Existen varios
tipos de microscopios electrónicos, que cada día se perfeccionan más.
El microscopio
electrónico de transmisión que utiliza un haz de electrones acelerados por un
alto voltaje (cien mil voltios). Este haz ilumina una sección muy fina de la
muestra, sean tejidos, células u otro material.
El microscopio
electrónico de barrido se utiliza para el estudio de la morfología y la
topografía de los elementos. Estos instrumentos utilizan voltajes cercanos a los
20.000 voltios. Las lentes magnéticas utilizan un haz muy fino de electrones
para penetrar repetidamente la muestra, y se produce una imagen ampliada de la
superficie observada en la pantalla de un monitor. El microscopio electrónico
mixto tiene propiedades comunes con el de transmisión y con el de barrido y
resulta muy útil para ciertas investigaciones. Hay otros microscopios
analíticos que detectan señales características de los elementos que
constituyen la muestra.
Con estos
poderosos instrumentos, que utilizan el flujo de electrones y las radiaciones
electromagnéticas así como la aplicación de técnicas histoquímicas y
bioquímicas, además del empleo de marcadores radiactivos, se han logrado
grandes avances en la biología celular.
Microscopio
electrónico de barrido.
El microscopio
electrónico de barrido está situado a la izquierda del operador, y las imágenes
computarizadas de la muestra se ven en la pantalla de la derecha. Aunque un
microscopio electrónico de transmisión puede resolver objetos más pequeños que
uno de barrido, este último genera imágenes más útiles para conocer la
estructura tridimensional de objetos minúsculos.
Microscopio quirúrgico
El empleo de
microscopios quirúrgicos ha permitido que los cirujanos lleven a cabo
intervenciones que parecían imposibles, como la reimplantación de un miembro y
la cirugía de los ojos y oídos. Estos microscopios son en especial útiles
cuando es necesario realinear para unir o reparar fibras nerviosas y vasos
sanguíneos individuales. Se usa para operaciones dificultosas.
Medición a través del microscopio
Muchas veces
interesa al observador conocer el tamaño real de los objetos o microorganismos
que está observando a través del microscopio. Para estas mediciones pueden
utilizarse varios métodos.
Método de los micrómetros.
Se utiliza para esto un micrómetro de platina o de objetivo, que consiste en un
portaobjetos en cuyo centro se halla una escala graduada (de 2 mm. de
longitud), con separaciones, entre cada división, de una centésima de
milímetro.
Además se utiliza
un micrómetro ocular que lleva una escala graduada en décimas de milímetros. Se
coloca el micrómetro objetivo sobre la platina y se enfoca el microscopio hasta
que las líneas de la escala graduada aparezcan nítidas. Luego se hace
superponer la escala del ocular y se toma como referencia las primeras
divisiones en que una línea del micrómetro objetivo y una línea del micrómetro
ocular coincidan o se superpongan exactamente.
Luego, por
simple regla de tres, se calcula el valor en mieras de cada división ocular.
Veamos un ejemplo. Si 9 divisiones del micrómetro objetivo (0,09mm) equivalen a
30 divisiones del micrómetro ocular, cada división del ocular equivaldrá a:
0,09/30 = 0,003 mm. = 3 µm
Quiere decir
que para el objetivo calibrado y el ocular utilizado, cada división del
micrómetro ocular equivale a 3 µm. Una vez obtenido este dato para cada
objetivo en la forma que hemos expuesto, teniendo el microscopio ocular podrían
hacerse todas las mediciones que se deseen. Para medir, por ejemplo, un Paramecium
de una preparación, procedemos así: haremos coincidir los extremos del
microorganismo con las divisiones del micrómetro ocular. Si la longitud del
organismo es de 75 divisiones del micrómetro ocular, y cada división equivale a
3 µm, la longitud del Paramecium será 75x3= 225 µm. También se pueden efectuar
mediciones en el microscopio con cámara clara y utilizando una regla. En
realidad, estas medidas no son tan exactas como cuando se utilizan micrómetros
por errores que se introducen superponiendo imágenes.
Mantenimiento del microscopio
El microscopio
debe estar protegido del polvo, humedad y otros agentes que pudieran dañarlo.
Mientras no esté en uso debe guardarse en un estuche o gabinete, o bien
cubrirlo con una bolsa plástica o campana de vidrio.
Las partes
mecánicas deben limpiarse con un paño suave; en algunos casos, éste se puede
humedecer con xilol para disolver ciertas manchas de grasa, aceite de cedro,
parafina, etc. Que hayan caído sobre las citadas partes.
La limpieza de
las partes ópticas requiere precauciones especiales. Para ello debe emplearse
papel de óptico que expiden las casas distribuidoras de material de laboratorio
ó fotografía o utilizar un paño de algodón. Para el polvillo se puede utilizar
un perilla con pincel de pelo de camello. Nunca deben tocarse las lentes del
ocular, objetivo y condensador con los dedos; las huellas digitales perjudican
la visibilidad, y cuando se secan resulta trabajoso eliminarlas.
Para una buena
limpieza de las lentes puede humedecerse el papel de óptica, envolviendo un
palillo con algo de punta con una solución de éter/alcohol (70-30 %) y
luego pasarlo por la superficie cuantas veces sea necesario. La limpieza de la
óptica ha de realizarse en espiral, desde el centro hacia el exterior. El
aceite de cedro que queda sobre la lente frontal del objetivo de inmersión debe
quitarse inmediatamente después de finalizada la observación. Para ello se
puede pasar el papel de óptica impregnado con una gota de xilol. En caso de
estar seco debe ponerse la zona a remojo con la solución señalada. Para
guardarlo se acostumbra colocar el objetivo de menor aumento sobre la platina y
bajado hasta el tope; el condensador debe estar en su posición más baja, para
evitar que tropiece con alguno de los objetivos. Guárdese en lugares secos,
para evitar que la humedad favorezca la formación de hongos. Ciertos ácidos y
otras sustancias químicas que producen emanaciones fuertes, deben mantenerse
alejados del microscopio.
Conclusiones
Dos
lentes convexas bastan para construir un microscopio. Cada lente hace
converger los rayos luminosos que la atraviesan. Una de ellas, llamada
objetivo, se sitúa cerca del objeto que se quiere estudiar. El objetivo forma
una imagen real aumentada e invertida. Se dice que la imagen es real porque los
rayos luminosos pasan realmente por el lugar de la imagen. La imagen es
observada por la segunda lente, llamada ocular, que actúa sencillamente como
una lupa. El ocular está situado de modo que no forma una segunda imagen real,
sino que hace divergir los rayos luminosos, que al entrar en el ojo del
observador parecen proceder de una gran imagen invertida situada más allá del
objetivo. Como los rayos luminosos no pasan realmente por ese lugar, se dice
que la imagen es virtual.
microscopio de 1852
Cronología del desarrollo del microscopio
•
1590: con posterioridad, algunos autores (Pierre Borel
1620 - 1671 o 1628 - 1689 y Willem Boreel 1591 - 1668) reivindican que en esta
fecha los fabricantes holandeses de anteojos, Hans Janssen y su hijo Zacharias
Janssen inventaron un microscopio compuesto, pero este hecho no se ha
podido verificar.
•
1609: Galileo Galilei desarrolla un occhiolino o microscopio compuesto
de una lente convexa y una cóncava.
•
1612: Galileo presenta el occhiolino al rey de Polonia Segismundo III.
•
1619: Cornelius Drebbel (1572 - 1633)
presenta en Londres, un microscopio compuesto de dos lentes convexas.
•
c.1622: Drebbel presenta su invento en Roma.
•
1624: Galileo presenta su occhiolino al Príncipe Federico Cesi, fundador de la Academia
de los Linces).
•
1625: Giovanni Faber de Bamberg (1574 - 1629),
miembro de la Academia de los Linces, acuña la palabra microscopio por analogía contelescopio.
•
1665: Robert Hooke publica Micrographia, una colección de
micrografías biológicas. Acuña la palabra célula para las estructuras que descubre en una corteza
de corcho.
•
1674: Anton van Leeuwenhoek inventa el microscopio
simple.
•
1931: Ernst Ruska y Max Knoll construyen
el primer microscopio electrónico.
•
1965: se desarrolla el primer microscopio
electrónico de barrido.
•
1981: Gerd Binnig y Heinrich Rohrer desarrollan
el microscopio de efecto túnel.
•
1985 Binnig y Rohrer desarrollan el microscopio
de fuerza atómica.
AUMENTOS
El ocular normalmente tiene un
aumento de 10x (la "x" indica "aumento") por lo que
amplifica una imagen 10 veces su tamaño normal.
En cuanto a los objetivos, por lo común tienen un aumento que
varía entre 4x a 45x. Lo normal es encontrar tres objetivos de distinto aumento
(4x, 10x y 40x) montados sobre una base giratoria que permite intercambiarlos
para aumentar, en forma creciente, el tamaño de la imagen. Una propiedad
importante de los objetivos es que normalmente invierten la imagen en todo
sentido (de derecha a izquierda y de arriba abajo) y, como el ocular no puede
reinvertirla, nosotros la observamos completamente al revés. Esto no es un
problema porque ¿quién sabe qué es arriba y qué abajo en una célula? pero
conviene tenerlo en cuenta porque cuando movemos el preparado, la imagen se
desplaza ante nuestros ojos en sentido contrario a lo que esperaríamos!!!.
La imagen resultante estará ampliada tantas veces como el producto
de las lentes con las que estoy observando, es decir que si utilizo un ocular
de 10x y un objetivo de 4x, veré la imagen cuarenta veces más grande que su
tamaño original.
Conviene destacar que existen dos tipos de objetivos: los de observación en seco y
los de inmersión. En el primer caso, el aumento varía de 4x a 45x y
alcanza con el índice de refracción del aire (de ahí el nombre "en seco",
por el aire!) para que la imagen se forme nítidamente, pero en el segundo caso,
al incrementar el aumento (las lentes de inmersión tienen aumentos de 90x o
100x) es necesario aumentar el índice de refracción entre el preparado y la
lente para lograr la imagen, para esto se utilizan aceites de cedro o sintético
y la lente se "sumerge" en ellos (de ahí el nombre "de
inmersión").
